btxonline PROTOCOL 0024說明書

PROTOCOL 0024

電解槽機械手ECM 600電穿孔協議
乳球菌亞種。乳酸菌LM0230
DNA:pGB301

ECM 630電協議

電解槽機械手ECM 600電穿孔協議
乳球菌亞種。乳酸菌LM0230
DNA:pGB301
細胞準備：
生長培養基：M17 Glu或M17 Lac
溫度：37攝氏度
電池密度：5 x 1010 CFU/ml
溫度：冰鎮
洗滌程序：顆粒5500 x g，4oC，10分鐘
洗滌1：再次洗滌，10毫升無菌冷dd-H2O
顆粒1200 x g至4oC，10分鐘
洗滌2：再次洗滌，10毫升無菌冷dd-H2O
顆粒1200 x g至4oC 15分鐘
洗滌3：再次洗滌，1毫升無菌冷dd-H2O
4oC下顆粒大速度3分鐘
終稀釋：再次使用1.25毫升無菌冷dd-H2O
（等份可在冰上保存不超過兩小時）

電穿孔設置：
選擇方式：T 2.5kV/電阻高壓（HV）
設置電容：C高壓時默認設置為50μF
設置電阻：R5（129歐姆）
腔室間隙：BTX一次性反應杯P/N 610（1mm間隙）
BTX扁平封裝室P/N 486（0.56 mm間隙）
設置充電電壓：S如果使用1毫米，設置1.70千伏
如果使用0.56毫米，設置0.95千伏
估計場強：17千伏/厘米
期望脈沖長度：t 5毫秒
電穿孔程序：
樣品體積：70μl
轉染體積：0.003-0.94μg
工作溫度：0oC-電穿孔前在冰上冷卻裝滿反應杯
脈沖：按A啟動自動充電和脈沖序列
稀釋介質：M17-葡萄糖肉湯系列稀釋液1:5，1:10，1:100
孵育：30oC，2小時
選擇方法：M17-Glu瓊脂上的抗生素選擇板
結果：1 x 103
轉化子/μg DNA
參考文獻：MyIntyre DA and Harlander SK，應用與環境微生物學，55（3）：604-610，1989（BTX ID#447）